Hydrofob Interaktionskromatografi - HIC

Hydrofob interaktionskromatografi (HIC) är en av de mest använda metoderna för separation och upprening av proteiner i dess nativa form. HIC används i flertalet olika analyser som till exempel för att karaktärisera oxiderade varianter av proteinbaserad läkemedel, isolera proteinkomplex, studera felveckning av proteiner och karaktärisera ADC (Antibody Drug Conjugate).

HIC separerar proteiner baserat på interaktioner mellan hydrofoba grupper på proteinet och den hydrofoba stationärfasen. HIC erbjuder fördelar då mobilfasen, i jämförelse med reversed phase, innehåller lite eller inget organiskt lösningsmedel vid fysiologiskt pH, vilket möjliggör analys av strukturförändringar i den nativa formen. För HIC är den mobila fasen lösningar med hög salthalt. När salthalten ökas ökar också hydrofobiciteten på proteinernas yta som därmed skapar interaktioner med stationärfasen. Proteinerna elueras från kolonnen när salthalten minskas, de minst hydrofoba proteinerna eluerar först och de mest hydrofoba proteinerna eluerar sist.

Oxiderade varianter

Terapeutiska proteinbaserade läkemedel är en snabbt växande klass av läkemedel som används mot bland annat cancer, infektionssjukdomar samt autoimmuna och kardiovaskulära sjukdomar. Under tillverkning, leverans och lagring kan dessa påverkas av en mängd olika biokemiska modifieringar som har visat sig påverka säkerheten och effekten. Detta ökar vikten av analytiska metoder för att upptäcka dessa modifierade varianter. Bland dessa modifieringar är oxidation av exponerade aminosyrarester såsom tryptofan (Trp) och metionin (Met) ett orosmoment i stabilitetsstudier då oxidation visat sig ha negativ effekt på hållbarhet och bioaktivitet.

Oxidation av aminosyrarester kan förändra den hydrofoba naturen hos proteinerna genom antingen den ökade polariteten hos den oxiderade formen eller den resulterande konformationsförändringen. Därför används oftast HPLC-metoder baserade på hydrofobicitet, såsom Reversed Phase kromatografi (RPLC) och hydrofobisk interaktionskromatografi (HIC) för att karakterisera oxiderade varianter.